Odstavec předpisu 124/2001 Sb.
Vyhláška č. 124/2001 Sb., kterou se stanoví požadavky na odběr vzorků a principy metod laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů a způsob uchovávání vzorků
Příl.10
Příl.10
Metody laboratorního zkoušení krmiv, doplňkových látek a premixů
Seznam chemických metod laboratorního zkoušení doplňkových látek, premixů
a krmných směsí s doplňkovými látkami a premixy
1. Stimulátory růstu
1.1. Stanovení obsahu avilamycinu
1.2. Stanovení obsahu olachindoxu, metoda převzatá ze směrnice Komise
98/64/ES
1.3. Stanovení obsahu monensinu
1.4. Stanovení obsahu salinomycinu
1.5. Stanovení obsahu tylosinu, metoda převzatá ze směrnice Komise 72/199/EHS
1.6. Stanovení obsahu zinkbacitracinu, metoda převzatá ze směrnice Komise
84/4/EHS
1.7. Stanovení obsahu flavofosfolipolu, metoda převzatá ze směrnice Komise
78/633/EHS
1.8. Stanovení obsahu avoparcinu, metoda převzatá ze směrnice Komise
81/715/EHS
1.9. Stanovení obsahu monensinu, metoda převzatá ze směrnice Komise 81/715/EHS
1.10. Stanovení obsahu spiramycinu, metoda převzatá ze směrnice Komise
84/425/EHS
1.11. Stanovení obsahu virginiamycinu, metoda převzatá ze směrnice Komise
84/4/EHS
2. Antikokcidika
2.1. Stanovení obsahu amprolia, metoda převzatá ze směrnice Komise 99/27/ES
2.2. Stanovení obsahu maduramicinu
2.3. Stanovení obsahu methylbenzochátu, metoda převzatá ze směrnice Komise
93/117/ES
2.4. Stanovení obsahu narasinu
2.5. Stanovení obsahu nikarbazinu
2.6. Stanovení obsahu robenidinu, metoda převzatá ze směrnice Komise
93/117/ES
2.7. Stanovení obsahu meticlorpindolu
2.8. Stanovení obsahu salinomycinu - je uvedeno v Příloze 10, část 1
2.9. Stanovení obsahu monensinu - je uvedeno v Příloze 10, část 1
2.10. Stanovení obsahu halofuginonu, metoda převzatá ze směrnice Komise
93/70/EHS
2.11. Stanovení obsahu ethopabátu
2.12. Stanovení obsahu semduramicinu
2.13. Stanovení obsahu diclazurilu, metoda převzatá ze směrnice Komise
99/27/ES
2.14. Stanovení obsahu carbadoxu, metoda převzatá ze směrnice Komise
99/27/ES
2.15. Stanovení obsahu olachindoxu je uvedeno v Příloze 10, část 1
2.16. Stanovení obsahu lasalocidu, metoda převzatá ze směrnice Komise
99/76/ES
3. Chemoterapeutika
3.1. Stanovení obsahu dimetridazolu
4. Vitaminy
4.1. Stanovení obsahu cholinu
4.2. Stanovení obsahu pantothenanu vápenatého
4.3. Stanovení obsahu vitaminu B1, B2, B6
4.4. Stanovení obsahu vitaminu B2
4.5. Stanovení obsahu vitaminu B6
4.6. Stanovení obsahu vitaminu A, metoda převzatá ze směrnice Komise
2000/45/ES
4.7. Stanovení obsahu vitaminu E, metoda převzatá ze směrnice Komise
2000/45/ES
4.8. Stanovení obsahu vitaminu D
5. Mikroprvky
5.1. Stanovení obsahu mědi, železa, manganu a zinku - je uvedeno v příloze
9, část 8
5.2. Stanovení obsahu kobaltu
5.3. Stanovení obsahu selenu
6. Výpočty
6.1. Vyhodnocování a výpočet výsledků stanovení obsahu doplňkových látek
pro difúzní plotnové postupy
7. Barviva
7.1. Stanovení obsahu beta-karotenu spektrofotometrickou metodou
8. Mikrobiotika
8.1. Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Streptococcus
8.2. Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Bacillus
1.
Stimulátory růstu
1.1. Stanovení obsahu avilamycinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu avilamycinu v krmivech a premixech.
Obsah avilamycinu
se stanoví po extrakci ze zkušebního vzorku chloroformem a přečištění extraktu na
pevné fázi Silica, vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi C18
s gradientovou elucí a UV detekcí při lambda = 295 nm.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Nestanovena.
1.2. Stanovení obsahu olachindoxu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu olachindoxu v krmivech. Obsah olachindoxu se stanoví
po extrakci směsí methanol - voda vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC)
na reverzní fázi s UV-detekcí.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními
prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu olachindoxu 10 až 20 mg/kg
15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.
Reprodukovatelnost
Je uvedena u metody.
Mez
stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 5 mg/kg
1.3. Stanovení obsahu monensinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu monensinu v krmivech a premixech.
Obsah monensinu se
stanoví po extrakci směsným rozpouštědlem, extrakt je přečištěn na pevné fázi a takto
přečištěný extrakt je rozpuštěn v definovaném objemu mobilní fáze. Monensin se stanovuje
vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi a po postkolonové
derivatizaci s p-dimethylaminobenzaldehydem při 90 st. C je detekován UV-detektorem
při vlnové délce 600 nm.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými
na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu monensinu:
do 25 mg/kg 20 % relat.
od
25 do 50 mg/kg 5 mg/kg
od 50 do 100 mg/kg 10 % relat.
od 100 do 200 mg/kg 10 mg/kg
nad
200 mg/kg 5 % relat.
Reprodukovatelnost
Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného
vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu monensinu:
do 25
mg/kg 40 % relat.
od 25 do 50 mg/kg 10 mg/kg
od 50 do 100 mg/kg 20 % relat.
od 100 do
200 mg/kg 20 mg/kg
nad 200 mg/kg 10 % relat.
Mez stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti
je 0,2 mg/kg
1.4. Stanovení obsahu salinomycinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu salinomycinu v krmivech a premixech.
Obsah salinomycinu
se stanoví po extrakci směsným rozpouštědlem, extrakt je přečištěn na pevné fázi
a takto přečištěný extrakt je rozpuštěn v definovaném objemu mobilní fáze. Salinomycin
se stanovuje vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi a po
postkolonové derivatizaci s p-dimethylaminobenzaldehydem při 90 st. C je detekován
UV-detektorem při vlnové délce 600 nm.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními
stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu salinomycinu:
do
25 mg/kg 20 % relat.
od 25 do 50 mg/kg 5 mg/kg
od 50 do 100 mg/kg 10 % relat.
od 100
do 200 mg/kg 10 mg/kg
nad 200 mg/kg 5 % relat.
Reprodukovatelnost
Rozdíl mezi dvěma
výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit
při obsahu salinomycinu:
do 25 mg/kg 40 % relat.
od 25 do 50 mg/kg 10 mg/kg
od 50 do
100 mg/kg 20 % relat.
od 100 do 200 mg/kg 20 mg/kg
nad 200 mg/kg 10 % relat.
Mez stanovitelnosti
Mez
stanovitelnosti je 1,4 mg/kg.
1.5. Stanovení obsahu tylosinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky
pro stanovení tylosinu v krmivech, koncentrátech a premixech od obsahu 2 mg/kg.
Vzorek
se podrobí působení fosfátového pufru pH 8 zahřátého na 80 st. C, potom se extrahuje
methanolem. Po odstředění se extrakt naředí a jeho antibiotická aktivita se stanoví
změřením difúze tylosinu na agaru s Kocuria rhizophila (CCM 552). V přítomnosti mikroorganizmu
se difúze projevuje tvorbou inhibičních zón. Průměr těchto zón je přímo úměrný logaritmu
koncentrace antibiotika.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými
na stejném vzorku nesmí překročit 10 % relat.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 2 mg/kg.
1.6. Stanovení obsahu zinkbacitracinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení zinkbacitracinu v krmivech a premixech.
Vzorek se extrahuje
při pH 2 směsí methanol-voda-kyselina chlorovodíková a roztokem síranu sodného. Přidání
síranu sodného slouží k vysrážení rozpustných solí mědi, které mohou při stanovení
rušit. Extrakt se upraví na pH 6,5, zakoncentruje se (je-li to nezbytné) a naředí.
Jeho antibiotická aktivita se stanovuje měřením difúze zinkbacitracinu v agaru, do
něhož byl naočkován mikroorganismus Micrococcus luteus (CCM 732). Difúze se projevuje
vytvořením inhibičních zón. Průměr těchto zón se považuje za přímo úměrný logaritmu
koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi
dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu
zinkbacitracinu:
od 5 do 10 mg/kg 2 mg/kg
od 10 mg/kg do 25 mg/kg 20 % relat. z vyššího
výsledku
od 25 mg/kg do 50 mg/kg 5 mg/kg
nad 50 mg/kg 10 % relat. z vyššího výsledku
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 5 mg/kg.
1.7. Stanovení obsahu flavofosfolipolu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení flavofosfolipolu v krmivech, koncentrátech a premixech.
Vzorek
se extrahuje zředěným methanolem za varu pod zpětným chladičem. Po odstředění se
extrakt přečistí (pokud je to třeba) na ionexu a naředí. Antibiotická aktivita vzorku
se stanoví měřením difúze flavofosfolipolu do agarové půdy, zaočkované mikroorganismem
Staphylococcus aureus (CCM 2022). Difúze se projeví tvorbou inhibičních zón. Průměr
těchto zón se považuje za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika v rozsahu
použitých koncentrací.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými
na stejném vzorku nesmí při obsahu flavofosfolipolu překročit
od 1 do 2 mg/kg 0,5
mg/kg
od 2 do 10 mg/kg 25 % relat. z vyššího výsledku
od 10 do 25 mg/kg 20 % relat.
z vyššího výsledku
od 25 do 50 mg/kg 5 mg/kg
nad 50 mg/kg 10 % relat. z vyššího výsledku
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 1 mg/kg.
1.8. Stanovení obsahu avoparcinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení avoparcinu v krmivech a premixech.
Přítomnost polyetherických
antibiotik může na stanovení působit rušivě.
Vzorek se extrahuje směsí aceton-voda-kyselina
chlorovodíková. Antibiotická aktivita extraktu se stanoví měřením difúze avoparcinu
v živném agaru zaočkovaném mikroorganismem Bacillus subtilis (CCM 1999). Difúze se
dokáže vznikem inhibičních zón mikroorganismu. Průměr těchto zón se považuje za přímo
úměrný logaritmu koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.
Opakovatelnost
Rozdíl
mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit
při obsahu avoparcinu:
do 10 mg/kg 2 mg/kg
od 10 do 25 mg/kg 20 % relat. z vyššího
výsledku
od 25 do 50 mg/kg 5 mg/kg
nad 50 mg/kg 10 % relat. z vyššího výsledku
Mez stanovitelnosti
Mez
stanovitelnosti je 2 mg/kg.
1.9. Stanovení obsahu monensinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu monensinu v krmivech a premixech.
Vzorek se extrahuje
90% methanolem. Extrakt se podrobí vhodnému postupu podle obsahu monensinátu sodného
ve vzorku. Jeho antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze monensinátu sodného
v agarové živné půdě zaočkované mikroroganizmem Bacillus subtilis (CCM 1999). Difúze
se projeví vznikem inhibičních zón testovacího organismu. Průměr těchto inhibičních
zón je v rozsahu použitých koncentrací považován za přímo úměrný logaritmu koncentrace
antibiotika. Citlivost Metodau je snížena přítomností sodných iontů.
Opakovatelnost
Rozdíl
mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit
při obsahu monensinu:
do 25 mg/kg 20 % relat. z vyššího výsledku
od 25 do 50 mg/kg
5 mg/kg
nad 50 mg/kg 10 % relat. z vyššího výsledku
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 10 mg/kg.
1.10. Stanovení obsahu spiramycinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu spiramycinu v krmivech a premixech.
Vzorek se extrahuje
směsným roztokem methanol-fosfátouhličitanovým tlumivým roztokem pH 8,0. Extrakt
se dekantuje nebo odstředí a naředí. Antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze
spiramycinu v agarové půdě zaočkované mikroorganismem Bacillus subtilis (CCM 1999).
Difúze se projeví tvorbou inhibičních zón mikroorganismu. Průměr zón se považuje
za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.
Opakovatelnost
Rozdíl
mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit
při obsahu spiramycinu:
do 10 mg/kg 2 mg/kg
od 10 do 25 mg/kg 20 % relat. z vyššího
výsledku
od 25 do 50 mg/kg 5 mg/kg
nad 50 mg/kg 10 % relat. z vyššího výsledku
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 1 mg/kg.
1.11. Stanovení obsahu virginiamycinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu virginiamycinu v krmivech a premixech.
Vzorek je extrahován
methanolickým roztokem Tween 80. Extrakt se dekantuje nebo odstředí a potom vhodně
naředí. Jeho antibiotická aktivita se stanovuje měřením difúze virginiamycinu v agaru,
do něhož byl naočkován mikroorganismus Kocuria rhizophila (CCM 552). Difúze se projevuje
vytvořením inhibičních zón. Průměr těchto zón se považuje za přímo úměrný logaritmu
koncentrace antibiotika v rozsahu použitých koncentrací.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi
dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu
virginiamycinu:
do 10 mg/kg 2 mg/kg
od 10 do 25 mg/kg 20 % relat. z vyššího výsledku
od
25 do 50 mg/kg 5 mg/kg
nad 50 mg/kg 10 % relat. z vyššího výsledku
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti 2 mg/kg.
2.
Antikokcidika
2.1. Stanovení obsahu amprolia
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky
pro stanovení obsahu amprolia v krmivech a premixech. Mez detekce je 1 mg/kg.
Vzorek
se extrahuje směsí methanol - voda. Po zředění extraktu mobilní fází a membránové
filtraci se obsah amprolia stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s výměnou
kationtů a s UV detekcí.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými
na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu amprolia:
od 25 do 500 mg/kg 15 % relat.
z vyššího výsledku
od 500 do 1000 mg/kg 75 mg/kg
nad 1000 mg/kg 7,5 % relat. z vyššího
výsledku
Reprodukovatelnost
Je uvedena u metody.
Mez stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti
je 25 mg/kg.
2.2. Stanovení obsahu maduramicinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu maduramicinu v premixech.
Obsah maduramicinu se stanoví
po extrakci vzorku extrakční směsí, následném přečištění na pevné fázi a postkolonové
derivatizaci vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s použitím
UV detekce při vlnové délce 598 nm.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními
prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu maduramicinu:
do 5 mg/kg
10 % relat.
od 800 do 1200 mg/kg 5 % relat.
Reprodukovatelnost
Rozdíl mezi dvěma výsledky
zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu
maduramicinu:
do 10 mg/kg 30 % relat.
od 10 do 30 mg/kg 3 mg/kg
nad 30 mg/kg 10 % relat.
Mez
stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 0,9 mg/kg.
2.3. Stanovení obsahu methylbenzochátu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu methylbenzochátu v krmivech a premixech.
Obsah methylbenzochátu
se stanoví po extrakci vzorku methanolovým roztokem methansulfonové kyseliny, po
přečištění extrakcí dichlormethanem je izolován na chromatografickém ionexovém sloupci
a znovu extrahován dichlormethanem, nakonec stanoven vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií
(HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními
stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu methylbenzochátu
od 4,0 do 20 mg/kg hodnotu 10 % relat. z vyššího výsledku.
Reprodukovatelnost
Je uvedena
u metody.
Mez stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 1 mg/kg.
2.4. Stanovení obsahu narasinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky
pro stanovení obsahu narasinu v krmivech a premixech.
Obsah narasinu se stanoví po
extrakci směsným rozpouštědlem, extrakt je přečištěn na pevné fázi a takto přečištěný
extrakt je rozpuštěn v definovaném objemu mobilní fáze. Narasin se stanoví vysokoúčinnou
kapalinovou chromatografií na reverzní fázi a po postkolonové derivatizaci s p-dimethylaminobenzaldehydem
při 90 st. C je detekován UV-detektorem při vlnové délce 600 nm.
Opakovatelnost
Rozdíl
mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit
při obsahu narasinu:
do 25 mg/kg 20 % relat.
od 25 do 50 mg/kg 5 mg/kg
od 50 do 100
mg/kg 10 % relat.
od 100 do 200 mg/kg 10 mg/kg
nad 200 mg/kg 5 % relat.
Reprodukovatelnost
Rozdíl
mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí
překročit při obsahu narasinu:
do 25 mg/kg 40 % relat.
od 25 do 50 mg/kg 10 mg/kg
od
50 do 100 mg/kg 20 % relat.
od 100 do 200 mg/kg 20 mg/kg
nad 200 mg/kg 10 % relat.
Mez
stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 1,4 mg/kg.
2.5. Stanovení obsahu nikarbazinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení nikarbazinu v krmivech a premixech.
Nikarbazin se stanoví po
extrakci ze vzorku extrakčním roztokem acetonitril - voda naředěním mobilní fází
vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi (RP - HPLC) s isokratickou
elucí na koloně C18 s UV detekcí při vlnové délce 351 nm.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez stanovitelnosti
Nestanovena.
2.6. Stanovení obsahu robenidinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení robenidinu v krmivech.
Vzorek se extrahuje okyseleným methanolem.
Extrakt se vysuší a jeho alikvotní část se přečistí na koloně s oxidem hlinitým.
Robenidin se eluuje z kolony methanolem, koncentruje se a na vhodný objem se upraví
pomocí mobilní fáze. Obsah robenidinu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií
(HPLC) na reverzní fázi pomocí UV detektoru.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními
stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí při obsahu robenidinu nad 15 mg/kg
překročit 10 % relat. vyššího výsledku.
Reprodukovatelnost
Je uvedena u metody.
Mez
stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 5 mg/kg.
2.7. Stanovení obsahu meticlorpindolu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu meticlorpindolu v krmivech a premixech.
Obsah meticlorpindolu
se stanoví po extrakci vzorku směsným rozpouštědlem methanolamoniak a po jeho převedení
do mobilní fáze vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi
s UV detekcí při 265 nm.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými
na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu meticlorpindolu:
do 100 mg/kg 5 % relat.
od
100 do 200 mg/kg 5 mg/kg
Reprodukovatelnost
Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného
vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu meticlorpindolu:
od
50 do 200 mg/kg 15 % relat.
Mez stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 3,6 mg/kg.
2.8. Stanovení obsahu salinomycinu
Metoda stanovení obsahu salinomycinu je
uveden v příloze č. 10, část 1.
2.9. Stanovení obsahu monensinu
Metoda stanovení obsahu monensinu je uveden
v příloze č. 10, část 1.
2.10. Stanovení obsahu halofuginonu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu halofuginonu v krmivech a premixech.
Obsah halofuginonu
se stanoví jako volná base po extrakci horkou vodou do ethylacetátu a následně se
rozdělí jako hydrochlorid do vodného kyselého roztoku. Extrakt se přečistí na ionexové
chromatografické koloně. Obsah halofuginonu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou
chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV-detekcí.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma
paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu
halofuginonu do 3 mg/kg hodnotu 0,5 mg/kg.
Reprodukovatelnost
Je uvedena u metody.
Mez
stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 1 mg/kg.
2.11. Stanovení obsahu ethopabátu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu ethopabátu v krmivech a premixech.
Obsah ethopabátu
se stanoví po extrakci vzorku methanolem a přečištění chromatografií na pevné fázi
vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s fluorescenční
detekcí.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném
vzorku nesmí překročit při obsahu ethopabátu:
do 1 mg/kg 40 % relat.
od 1 do 4 mg/kg
0,4 mg/kg
od 4 do 20 mg/kg 10 % relat.
od 20 do 1000 mg/kg nestanovena
nad 1000 mg/kg
5 % relat.
Reprodukovatelnost
Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými
ve dvou laboratořích nesmí překročit při obsahu ethopabátu:
do 1 mg/kg nestanovena
od
1 do 20 mg/kg 20 % relat.
od 20 do 1000 mg/kg nestanovena
nad 1000 mg/kg 15 % relat.
Mez
stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 0,03 mg/kg.
2.12. Stanovení obsahu semduramicinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu semduramicinu v krmivech a premixech.
Obsah semduramicinu
se stanoví po extrakci vzorku extrakční směsí, následném přečištění na pevné fázi
a postkolonové derivatizaci vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní
fázi s použitím UV detekce při vlnové délce 598 nm.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Nestanovena.
2.13. Stanovení obsahu diclazurilu
Účel, rozsah a princip
Metoda určuje podmínky
pro stanovení obsahu diclazurilu v krmivech a premixech. Mez detekce je 0,1 mg/kg.
Vzorek
se po přidání interního standardu extrahuje okyseleným methanolem. U krmiv se alikvotní
část extraktu přečistí na SPE patroně C18. Diclazuril se z patronky eluuje směsí
okyseleného methanolu a vody. Po odpaření se zbytek rozpustí ve směsi dimethylformamidu
a vody. U premixů se extrakt odpaří a zbytek se rozpustí ve směsi dimethylformamidu
a vody. Obsah diclazurilu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC)
na reverzní fázi s ternárním gradientem a UV-detekcí.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma
paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu
diclazurilu:
do 2,5 mg/kg 30 % relat. z vyššího výsledku
od 2,5 do 5 mg/kg 0,75 mg/kg
nad
5 mg/kg 15 % relat. z vyššího výsledku
Reprodukovatelnost
Je uvedena u metody.
Mez stanovitelnosti
Mez
stanovitelnosti je 0,5 mg/kg.
2.14. Stanovení obsahu carbadoxu
Účel, rozsah a princip
Metoda určuje podmínky
pro stanovení obsahu carbadoxu v krmivech, premixech a doplňkových látkách. Mez detekce
je 1 mg/kg.
Vzorek se zvlhčí vodou a extrahuje směsí methanol - acetonitril. Alikvotní
podíl extraktu krmiva se po filtraci přečistí na koloně s oxidem hlinitým. Extrakt
z premixů a doplňkových látek se přímo ředí na vhodnou koncentraci směsí voda - methanol
- acetonitril. Obsah carbadoxu se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií
na reverzní fázi s UV detekcí.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními
prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit při obsahu carbadoxu 10 mg/kg a vyšším
15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.
Reprodukovatelnost
Je uvedena u metody.
Mez
stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 10 mg/kg.
2.15. Stanovení obsahu olachindoxu
Metoda stanovení obsahu olachindoxu je
uvedena v příloze č. 10, část 1.
2.16. Stanovení obsahu lasalocidu
Účel, rozsah a princip
Metoda určuje podmínky
pro stanovení obsahu sodné soli lasalocidu v krmivech, premixech a doplňkových látkách.
Mez detekce je 5 mg/kg.
Lasalocid sodný se extrahuje ze vzorku okyseleným methanolem
a stanoví se vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s fluorescenční
detekcí.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném
vzorku nesmí překročit při obsahu lasalocidu:
do 100 mg/kg 15 % relat. z vyššího výsledku
od
100 do 200 mg/kg 15 mg/kg
nad 200 mg/kg 7,5 % relat. z vyššího výsledku
Reprodukovatelnost
Je
uvedena u metody.
Mez stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 30 mg/kg.
3.
Chemoterapeutika
3.1. Stanovení obsahu dimetridazolu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu dimetridazolu v krmivech a premixech.
Obsah dimetridazolu
se stanoví po extrakci vzorku 90% methanolem. Následně se přečistí na pevné fázi
a stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) na reverzní fázi s UV detekcí
při 309 nm.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na
stejném vzorku nesmí překročit při obsahu dimetridazolu:
od 3 do 30 mg/kg 15 % relat.
od
30 do 100 mg/kg 5 mg/kg
nad 100 mg/kg 5 % relat.
Reprodukovatelnost
Rozdíl mezi dvěma
výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit
při obsahu dimetridazolu:
od 3 do 25 mg/kg 20 % relat.
od 25 do 50 mg/kg 5 mg/kg
nad
50 mg/kg 10 % relat.
Mez stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 3 mg/kg.
4.
Vitaminy
4.1. Stanovení obsahu cholinu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky
pro stanovení obsahu cholinu v krmivech a premixech.
Obsah cholinu se stanoví po hydrolýze
vzorku hydroxidem barnatým a přečištění hydrolyzátu na ionexu na základě vzniku komplexu
s reineckátem amonným v prostředí roztoku fosforečnanu sodného spektrofotometricky
po rozpuštění komplexu v acetonu při vlnové délce 525 nm. Alternativně je možno provádět
stanovení cholinu metodou ITP.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma výsledky zkoušek stejného
vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit 10 % relat.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 20 mg/kg.
4.2. Stanovení obsahu pantothenanu vápenatého
Účel, rozsah a princip
Metoda
specifikuje podmínky pro stanovení obsahu pantothenanu vápenatého v premixech.
Obsah
pantothenanu vápenatého se stanoví na základě stimulačního účinku na růst testovacího
mikroorganismu Saccharomyces carlsbergensis CCM 4288 (ATCC 9080) difúzním plotnovým
Metodaem.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez stanovitelnosti
Nestanovena.
4.3. Stanovení vitaminů B1, B2, B6
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu vitaminů B1, B2, B6 v krmných směsích.
Vitaminy B1 (thiamin),
B2 (riboflavin) a B6 (pyridoxin) se extrahují ze vzorku krmiva vodou a po hydrolýze
kyselinou chloristou se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s
využitím iontových párů na reverzní fázi. Detekce vitaminu B2 a B6 se provádí přímo
fluorescenční detekcí, zatímco vitamin B1 se před detekcí nejprve oxiduje derivatizačním
činidlem v reakční smyčce postkolonové derivatizace.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Nestanovena.
4.4. Stanovení obsahu vitaminu B2
Účel, rozsah a princip
Používají se dvě
metody stanovení obsahu vitaminu B2 v premixech - metoda fluorometrická a metoda
difúzně plotnová.
Obsah vitaminu B2 se stanoví fluorometricky v mírně okyseleném prostředí
na základě fluorescence při vlnové délce 440 nm nebo difúzně plotnovou metodou na
základě stimulačního účinku na růst testovacího mikroorganismu Lactobacillus rhamnosus
CCM 1825 (ATCC 7469).
Opakovatelnost
Pro metodu fluorometrickou nestanovena.
Pro metodu
difuzní plotnovou:
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném
vzorku nesmí při obsahu vitaminu B2 500 000 mg/kg překročit hodnotu 40 500 mg/kg.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Nestanovena.
4.5. Stanovení obsahu vitaminu B6
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu vitaminu B6 v premixech.
Vitamin B6 ve všech jeho formách
se stanoví na základě stimulačního účinku na růst testovacího mikroorganismu kvasinky
Saccharomyces carlsbergensis CCM 4228 (ATCC 9080) difúzním plotnovým způsobem.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Nestanovena.
4.6. Stanovení obsahu vitaminu A
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu vitaminu A v krmivech a premixech. Vitamin A zahrnuje
all-trans retinol a jeho cis izomery, které se touto metodou stanoví. Obsah vitaminu
A se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách (IU) na kg. Mezinárodní jednotka odpovídá
aktivitě 0,3 mikrog all-trans vitaminu A (alkohol) nebo 0,344 mikrog all-trans vitamin
A (acetát) nebo 0,550 mikrog all-trans vitaminu A (palmitát).
Vzorek se hydrolyzuje
ethanolickým roztokem hydroxidu draselného a vitamin A se extrahuje petroletherem.
Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a pokud je to nutné, naředí
se na vhodnou koncentraci. Obsah vitaminu A se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou
chromatografií na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV nebo fluorescenční detekcí. Chromatografické
parametry jsou vybrány tak, aby nedocházelo k separaci all-trans vitaminu A (alkohol)
a jeho cis izomerů.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými
na stejném vzorku nesmí překročit 15 % relat. z hodnoty vyššího výsledku.
Reprodukovatelnost
Je
uvedena u metody.
Mez stanovitelnosti
Mez stanovitelnosti je 2000 m.j./kg.
4.7. Stanovení obsahu vitaminu E
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu vitaminu E v krmivech a premixech. Obsah vitaminu E
se vyjadřuje jako mg DL-alfa-tokoferol acetátu na kg. 1 mg DL-alfa-tokoferol acetátu
odpovídá 0,91 mg DL-alfa-tokoferolu (vitamin E).
Vzorek se hydrolyzuje ethanolickým
roztokem hydroxidu draselného a vitamin E se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo
se odpaří a zbytek se rozpustí v methanolu a pokud je to nutné, naředí se na vhodnou
koncentraci. Obsah vitaminu E se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií
na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV nebo fluorescenční detekcí.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi
dvěma paralelními stanoveními prováděnými na stejném vzorku nesmí překročit 15 %
relat. z vyššího výsledku.
Reprodukovatelnost
Je uvedena u metody.
Mez stanovitelnosti
Mez
stanovitelnosti je 2 mg/kg.
4.8. Stanovení obsahu vitaminu D
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje
podmínky pro stanovení obsahu vitaminu D v krmivech.
Vitamin D se stanoví po alkalické
hydrolýze vzorku hydroxidem draselným za studena, následné extrakci do hexanu, přečištění
na semipreparativní koloně Silica metodou HPLC. Frakce vitaminu D se zachytí, odpaří
se k suchu a odparek se rozpustí v methanolu. V extraktu se stanoví obsah vitaminu
D vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na analytické koloně s reverzní fází C18
s UV detekcí při 265 nm.
Opakovatelnost
Rozdíl mezi dvěma paralelními stanoveními prováděnými
na stejném vzorku nesmí překročit 20 % relat.
Reprodukovatelnost
Rozdíl mezi dvěma
výsledky zkoušek stejného vzorku prováděnými ve dvou laboratořích nesmí překročit
30 % relat.
Mez stanovitelnosti
Nestanovena.
5.
Mikroprvky
5.1. Stanovení obsahu mědi, železa, manganu a zinku
Metoda stanovení obsahu
mědi, železa, manganu a zinku je uvedena v příloze č. 9, část 8.
5.2. Stanovení obsahu kobaltu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky
pro stanovení obsahu kobaltu v krmivech.
Obsah kobaltu se stanoví po mineralizaci
vzorku v chloridovém výluhu metodou atomové absorpční spektrometrie (AAS).
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Nestanovena.
5.3. Stanovení obsahu selenu
Účel, rozsah a princip
Metoda specifikuje podmínky
pro stanovení selenu v krmivech.
Ve vzorku se po rozkladu kyselinou dusičnou v uzavřeném
systému stanoví obsah selenu metodou atomové absorpční spektrometrie (AAS).
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Nestanovena.
6.
Výpočty
6.1. Vyhodnocování a výpočet výsledků stanovení obsahu doplňkových látek
pro difúzně plotnové metody
Účel, rozsah a princip
Metoda uvádí a specifikuje uzančně
závazný způsob pro vyhodnocování a výpočet výsledků při stanovení obsahu doplňkových
látek v krmivech a premixech pro difúzně plotnové metody.
Průměry inhibičních, resp.
stimulačních zón, vzniklých při stanovení doplňkových látek difusně plotnovou metodou,
se měří s přesností nejméně na 0,1 mm. Ze souboru takto získaných hodnot se vypočítá
aritmetický průměr pro každou koncentraci zkoušeného vzorku i standardu.
7.
Barviva
7.1. Stanovení beta-karotenu spektrofotometrickou metodou
Účel, rozsah a
princip
Beta-karoten je přírodní barvivo chemicky patřící do skupiny tetraterpenoidů
a je provitaminem vitaminu A.
Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu beta-karotenu
v krmivech.
Stanoví se po enzymatické hydrolýze směsí enzymů pepsin - trypsin (1 :
1) v alkalickém prostředí, rozpuštěním v acetonu a následnou extrakcí do hexanu,
spektrofotometricky při vlnové délce 451 nm.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
Mez
stanovitelnosti
Nestanovena.
8.
Mikrobiotika
8.1. Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Enterococcus
Účel, rozsah a princip
Metoda
specifikuje podmínky pro stanovení počtu zárodků rodu Streptococcus skupiny D (Enterococcus)
v krmivech a premixech.
Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Enterococcus se provádí
na selektivních půdách podle Slanetze a Bartleye. Jako referenční půda se při stanovení
používá další selektivní půda (např. KF agar) nebo u premixů vhodná neselektivní
půda. Naočkované půdy jsou kultivovány při 37 st. C +/- 1 st. C. Růst a počty kolonií
se vyhodnocují po dvou a čtyřdenní kultivaci.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.
8.2. Stanovení počtu zárodků bakterií rodu Bacillus
Účel, rozsah a princip
Metoda
specifikuje podmínky pro stanovení počtu zárodků rodu Bacillus v krmivech.
Stanovení
počtu zárodků bakterií rodu Bacillus se provádí anaerobní kultivací na krevním agaru
při 37 st. C. Počty kolonií, charakteristické pro dané mikroorganismy, se vyhodnocují
po 18 - 24 hodinách.
Opakovatelnost
Nestanovena.
Reprodukovatelnost
Nestanovena.