Odstavec předpisu 409/2005 Sb.
Vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 409/2005 Sb., o hygienických požadavcích na výrobky přicházejícími do přímého styku s vodou a na úpravu vody
Příl.4

Pro zkoušku dezinfekčního účinku chemických látek nebo chemických směsí se používají sbírkové kmeny Escherichia coli (E. coli) CCM 3954 a Enterococcus faecalis CCM 4224 vzhledem k jejich hygienickému významu a morfologické charakteristice. Zkouška se provádí v nedezinfikované podzemní vodě, která svou fyzikálně-chemickou kvalitou odpovídá požadavkům zvláštního právního předpisu³⁾. U dezinfekčních přípravků určených pro speciální případy (povodně, lokální kontaminace, havárie apod.) je nutné provést zkoušku dezinfekčního účinku přípravku v nedezinfikované vodě se zvýšeným zatížením běžnými organickými látkami s CHSK-Mn (chemická spotřeba kyslíku manganistanem) 10 mg/l vody s tolerancí +/- 15 %. Tato voda však nesmí být kontaminována biocidními látkami ve smyslu zákona č. 120/2002 Sb.

Při zkoušce dezinfekční účinnosti přípravku se postupuje dle návodu k použití pro spotřebitele, který musí být jednoznačný a musí mj. uvádět i obsah aktivní látky (látek) v koncentrovaném dezinfekčním přípravku i v jeho doporučeném účinném množství. Pro zkoušení se použije výrobcem doporučené účinné množství (koncentrace) dezinfekčního přípravku; v případě uváděného širšího rozmezí účinného množství dezinfekčního přípravku pak nejnižší doporučené množství (koncentrace) (popř. více koncentrací včetně nejnižší doporučené).

Kmen E. coli CCM 3954, kmen Enterococcus faecalis CCM 7000, média předepsaná v normách pro stanovení E. coli (ČSN EN ISO 9308-1) a E. faecalis (ČSN EN 7899-2), nedezinfikovaná podzemní voda (viz bod 1.), pipety, sterilní skleněné vzorkovnice (Petriho misky o průměru 90 nebo 100 mm), zkumavky, Erlenmayerovy baňky (objem 2-3 litry), termostat. Kromě pomůcek dodávaných již ve sterilním stavu musí být laboratorní sklo sterilizováno podle pokynů uvedených v ČSN ISO 8199:1994 Jakost vod - Obecné pokyny pro stanovení mikroorganismů kultivačními metodami.

Odměřený objem (např. 1 litr) nedezinfikované podzemní vody nebo vody zatížené organickými látkami (viz bod 1.) se nalije do dvou Erlenmayerových baněk. Voda o teplotě (23 +/- 2) st. C se v obou baňkách uměle kontaminuje kmeny E. coli a Enterococcus faecalis tak, aby výchozí počet kolonie tvořících jednotek (KTJ) obou kmenů dosahoval hodnoty 1000 - 3000 KTJ/ml (příprava pomocí RM materiálů). Před vlastní zkouškou se musí kontaminovaná voda dokonale promíchat (např. protřepáním), aby se dosáhlo stejnoměrného rozptýlení mikroorganismů.

Do první baňky se přidá odpovídající účinné množství dezinfekčního přípravku a obsah baňky se opět dokonale promíchá, aby se dosáhlo stejnoměrného rozptýlení dezinfekčního přípravku. Ve zkušebních intervalech - 0 min (tzn. těsně před nadávkováním dezinfekčního přípravku do baňky), 5 min, 10 min, 15 min, 20 min a 30 min se 1 ml takto připraveného vzorku roztoku naočkuje na povrch pevného kultivačního media (plotny) a po kultivaci po dobu 24 a 48 hodin při teplotě (36 +/- 2) st. C se spočítají kolonie, které vyrostou na jeho povrchu. Během zkušební doby se zkušební roztok v baňce neustále promíchává. Délka trvání a teplota inkubace má být zvolena tak, aby vyhovovala odkazům na normalizované metody (ČSN EN ISO 7899- 2 Jakost vod - Stanovení intestinálních enterokoků - Část 2: Metoda membránových filtrů; ČSN EN ISO 9308-1 Jakost vod - Stanovení Escherichia coli a koliformních bakterií - Část 1: Metoda membránových filtrů). Zkouška musí být provedena paralelně.

Druhá baňka je použita jako kontrola. Ve zkušebních intervalech - 0 min a 30 min se 1 ml kontrolního vzorku kontaminované vody naočkuje na povrch pevného kultivačního media (plotny) v ředění 10-1 a 10 -2 a po kultivaci po dobu 24 a 48 hodin při teplotě (36 +/- 2) st. C se spočítají kolonie, které vyrostou na jeho povrchu. Během zkušební doby se zkušební roztok v baňce neustále promíchává. Zkouška musí být provedena paralelně. Počet kolonie tvořících jednotek (KTJ) ve zkušebním intervalu 30 min se po kultivaci nesmí lišit od výchozího počtu kolonie tvořících jednotek (KTJ) o více než 10 %.

Plotny musí být vyhodnocovány ihned po kultivaci. Výsledek se vyjadřuje procentuálně ze vztahu výchozího počtu kolonie tvořících jednotek (KTJ) zkoušených kmenů E. coli a Enterococcus faecalis a počtu kolonie tvořících jednotek (KTJ) pro každý zkušební interval samostatně.

Požadavek na účinnost dezinfekčních přípravků určených k úpravě vody na vodu pitnou nebo teplou je dán počtem kolonií tvořících jednotek po zkušebním intervalu 30 min (popř. po kratší zkušební době, pokud ji výrobce udává v návodu k použití). V případě obou sbírkových kmenů E. coli CCM 3954 a Enterococcus faecalis CCM 4224 musí být splněn požadavek 0 KTJ/ml

Ke zkoušení algicidních přípravků je používán standardní test podle ČSN EN ISO 8692 (757740).

Jednodruhové řasové kmeny se po několik generací kultivují v definovaném médiu, které obsahuje koncentrační řadu zkoušeného přípravku a které se připravuje smícháním odpovídajících objemů zásobního roztoku živin, vody, zásobního roztoku zkoušeného přípravku a inokula - exponenciálně rostoucích řasových buněk. Zkoušené roztoky se inkubují za konstantních fyzikálních podmínek nejméně 72 hodin. V době inkubace se v nich měří hustota buněk alespoň 1krát za 24 hodin. Zkoušené algicidní přípravky jsou přidávány v poměrech uvedených výrobcem v návodu k použití.

Inhibice se měří jako snížení růstu nebo růstové rychlosti v poměru k růstu kontrolních kultur pěstovaných za stejných podmínek. Pozitivní výsledek, indikující účinnost zkoušeného přípravku, je inhibice intenzity růstu zkoušené kultury o více než 30 % ve srovnání s kontrolou.